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重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌體系中的可溶性表達策略

發(fā)表時間:2023-12-29 訪問次數(shù):805

大腸桿菌表達體系因其表達量高、周期短、成本低等諸多優(yōu)勢特征而被廣泛用作重組異源蛋白質(zhì)的表達宿主。據(jù)統(tǒng)計超過30%的重組蛋白質(zhì)藥物和50%重組蛋白質(zhì)的制備是使用大腸桿菌作為表達宿主。蛋白質(zhì)錯誤折疊或未折疊以及包涵體形成是大腸桿菌表達體系更廣泛應(yīng)用的主要阻礙。因此,重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌體系中可溶性表達策略探索意義重大。

盡管大腸桿菌表達體系有許多優(yōu)點,但是在實際應(yīng)用中也仍然存在一些不足之處主要包括(1)缺乏翻譯后修飾。相較于真核表達體系,原核表達系統(tǒng)最大的局限性之一在于其缺乏類似于真核生物翻譯后修飾的能力,如糖基化修飾、二硫鍵氧化形成等。這些修飾與重組蛋白質(zhì)的可溶性、穩(wěn)定性及生物活性密切有關(guān)。(2)無輔助蛋白質(zhì)折疊機制。原核表達體系缺乏輔助蛋白質(zhì)折疊機制,重組蛋白質(zhì)在原核表達體系表達過程中通常以一種自發(fā)折疊的方式形成特定結(jié)構(gòu)對于部分結(jié)構(gòu)復(fù)雜、疏水性強的蛋白質(zhì)易于導(dǎo)致錯誤折疊最終形成無活性的包涵體(IBs)。據(jù)估計大約只有30%異源蛋白質(zhì)可以在大腸桿菌中以可溶性形式表達,其余以包涵體的不溶性聚集物表達,或在細胞提取物中無法檢測到是蛋白質(zhì)生產(chǎn)和純化過程中不可忽視的瓶頸,所以通過優(yōu)化表達策略,改善異源蛋白質(zhì)在原核表達體系中的可溶性表達也是目前研究的焦點。

那么,重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌中通過哪些途徑形成包涵體的呢?
自身氨基酸組成重組蛋白質(zhì)氨基酸組成中含硫氨基酸及脯氨酸的數(shù)量和比例能夠顯著影響重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達形式,含量越高重組蛋白質(zhì)更容易形成包涵體。
親疏水性強弱:從本質(zhì)上講,蛋白質(zhì)的折疊過程在一定程度上是由疏水相互作用驅(qū)動的,同時蛋白質(zhì)的聚集過程極大程度是分子間疏水作用的結(jié)果。蛋白質(zhì)自身疏水性越強,分子間更容易因疏水作用引發(fā)聚集,使蛋白質(zhì)錯誤折疊的概率越大。
蛋白質(zhì)合成速度:與真核表達系統(tǒng)不同,大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄和翻譯是快速且緊密耦合的,而快速的蛋白質(zhì)合成速度對具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的折疊卻是致命的。由于許多真核生物蛋白質(zhì)需要更長時間和/或折疊伴侶的幫助才能折疊成它們的天然狀態(tài),蛋白質(zhì)合成速率提高一方面通常會導(dǎo)致沒有足夠時間進行正確的結(jié)構(gòu)折疊,另一方面蛋白質(zhì)過快合成使重組蛋白質(zhì)折疊前體快速積累致使缺乏足夠的折疊空間極大程度上增加了重組蛋白質(zhì)之間的相互作用,形成蛋白質(zhì)聚核,促使并加速更多蛋白質(zhì)聚集,聚集部分折疊、未折疊或錯誤折疊的不溶性蛋白質(zhì)。
重組蛋白質(zhì)分子大小及結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度:大腸桿菌的平均蛋白質(zhì)長度為317個殘基,而人類的平均蛋白質(zhì)長度為510個殘基。重組蛋白質(zhì)分子越大,結(jié)構(gòu)往往越復(fù)雜,其所涉及的結(jié)構(gòu)域通常越多,在蛋白質(zhì)折疊過程中需要克服的分子勢能壁壘就越多,其折疊成為準確結(jié)構(gòu)的概率就越低。因此分子結(jié)構(gòu)更復(fù)雜、尺寸更大的蛋白質(zhì)在大腸桿菌系中的表達常伴隨著因未能及時正確折疊或本身疏水性結(jié)構(gòu)異常暴露而聚集形成包涵體的風險就會越高。

蛋白質(zhì)折疊過程示意圖

結(jié)構(gòu)折疊難易程度:重組蛋白質(zhì)中高級結(jié)構(gòu)類型,特別是二級結(jié)構(gòu)的組成比例能夠顯著影響蛋白質(zhì)的折疊速度。有研究表明α螺旋結(jié)構(gòu)的折疊速度相比于β發(fā)夾結(jié)構(gòu)的折疊速度快近30倍。
二硫鍵形成與否及數(shù)量:蛋白質(zhì)中的二硫鍵由兩個半胱氨酸殘基的硫原子共價連接形成,對蛋白質(zhì)正確折疊、結(jié)構(gòu)剛性、熱力學穩(wěn)定性和生物活性至關(guān)重要。在大腸桿菌中表達含有二硫鍵的重組蛋白質(zhì),往往容易因為其天然剛性結(jié)構(gòu)難以形成而導(dǎo)致重組蛋白質(zhì)間互相交聯(lián)在一起,形成不溶性的無活性聚集體,這種情況即使重組蛋白質(zhì)分泌至周質(zhì)中,通常也難以氧化形成正確的空間結(jié)構(gòu),需要借助二硫鍵氧化酶或分子伴侶才能得以完成。

可溶性和功能性蛋白質(zhì)的制備獲取是生物工業(yè)應(yīng)用的主要目標之一,自然途徑難以獲得令人滿意的產(chǎn)量,通過原核表達體系制備高效、低成本功能性重組蛋白質(zhì)成為越來越廣泛的選擇。影響重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌體系中表達形式及表達水平的因素很多可分為主觀性因素和客觀性因素。主觀性因素包括蛋白質(zhì)自身結(jié)構(gòu)、氨基酸組成、親疏水性及二硫鍵數(shù)量等,客觀性因素包括表達場所、分子伴侶(融合/非融合)、宿主類型、誘導(dǎo)策略、載體類型等。改善或提高重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌體系中可溶性表達的策略主要針對以上主客觀因素進行優(yōu)化。

影響重組蛋白質(zhì)包涵體形成的因素


密碼子偏好性優(yōu)化:參與蛋白質(zhì)翻譯過程中氨基酸識別與轉(zhuǎn)運的密碼子組成具有簡并性和物種偏好性。密碼子偏好性對重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌表達體系中的表達有著直接影響,蛋白質(zhì)的正確折疊依賴于基因的順暢表達,如含有大量單個或少量串列稀有密碼子(包括AGA、AGG、AUA、CCG、CCT、CTC、CGA和GTC等)的目的基因在大腸桿菌中更容易出現(xiàn)翻譯限速,甚至停滯的現(xiàn)象,導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊錯誤。因此,重組蛋白質(zhì)目的基因密碼子的偏好性優(yōu)化對提高重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌表達體系中的高水平表達具有重要意義。
重組蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達溫度優(yōu)化:溫度對大腸桿菌生長、質(zhì)粒穩(wěn)定性、重組蛋白質(zhì)表達速度及蛋白質(zhì)折疊效率等有顯著影響。大腸桿菌的最佳培養(yǎng)溫度一般為37℃,此溫度可能并不總是有利于目的基因在大腸桿菌中表達。在較低溫度下,細菌生命代謝速度減慢,降低轉(zhuǎn)錄、翻譯速度,較慢的翻譯速率有利于蛋白質(zhì)正確折疊,同時溫度降低時聚集作用也得以減弱,有利于蛋白質(zhì)折疊和提高重組蛋白質(zhì)可溶性表達比例。
表達載體選擇與優(yōu)化:表達載體通常包括復(fù)制子、篩選標記基因、啟動子及轉(zhuǎn)錄終止子等元件,大腸桿菌的常用表達載體包括pET系列、pCold系列、pBV系列和pGEX系列等。不同載體之間包含的元件類型和數(shù)量具有明顯差異。載體的啟動子類型對目的基因表達水平和表達方式(可溶或不可溶)的影響非常顯著。常見大腸桿菌表達體系的啟動子類型包括來源于細菌的lac、tac、trp、araBAD啟動子,以及來源于噬菌體的T7、T5、SP6啟動子。pET表達載體因其具有T7強啟動子而獲得較高表達量,是最常使用的啟動子類型。
誘導(dǎo)策略及優(yōu)化:異丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)是原核表達體系最常用的重組蛋白質(zhì)表達誘導(dǎo)劑之一。通過調(diào)節(jié)IPTG濃度來調(diào)控重組蛋白質(zhì)的表達速度,促進蛋白質(zhì)可溶性表達,建議在10μmol/L以下濃度范圍內(nèi)優(yōu)化;在大腸桿菌乳糖操縱子表達系統(tǒng)中,無須額外加入IPTG誘導(dǎo)劑的自動誘導(dǎo)表達策略也是常見的更加溫和的誘導(dǎo)方式;熱誘導(dǎo)不用添加外來誘導(dǎo)物,成本低,但是發(fā)酵過程中加熱升溫培養(yǎng),細菌的生長和代謝均加速,在一定程度上加快了重組蛋白質(zhì)的翻譯合成速度,增加蛋白質(zhì)折疊負擔;因此可以嘗試在誘導(dǎo)時將培養(yǎng)溫度升高至42℃后維持15~30 min,讓cIts857蛋白充分變構(gòu)失活,解除阻遏,啟動轉(zhuǎn)錄,然后再將培養(yǎng)溫度降低至35℃以下,降低細菌的新陳代謝和重組蛋白質(zhì)表達速度,減輕蛋白質(zhì)折疊負擔;低溫誘導(dǎo)能夠降低大腸桿菌的新陳代謝,進而降低重組蛋白質(zhì)合成速度,降低有聚集傾向的重組蛋白質(zhì)折疊前體累積,一定程度上減少包涵體形成的概率和提高可溶性表達比例。
大腸桿菌表達宿主選擇為了提高蛋白質(zhì)表達水平,促進二硫鍵形成,提高蛋白質(zhì)正確折疊,改善蛋白質(zhì)可溶性表達比例,各種類型的大腸桿菌宿主細胞被設(shè)計與改造。常見的大腸桿菌宿主包括E. coli BL21系列、Rosetta系列和Origami系列等。
 大腸桿菌表達體系常用宿主亞型類型 Commonly used commercial available E. coli host bacteria

大腸桿菌
宿主類型
功能應(yīng)用 特征 抗性特征
BL21 常規(guī)表達 非毒性蛋白的高水平表達,不能用于由T7啟動子驅(qū)動的蛋白質(zhì)表達
BL21(DE3)   T7 RNA聚合酶,可用于T7、lac、tac、trc及trp啟動子控制的目的基因表達
BL21Star(DE3)   RNase E基因突變失活,防止轉(zhuǎn)錄后mRNA的快速降解
BL21(DE3) plysS 毒性蛋白表達,稀有密碼子基因表達 含有表達T7溶菌酶的基因,可降低目的基因的背景表達水平,但不干擾目的蛋白表達 氯霉素
Rossatta (DE3)   6種稀有密碼子質(zhì)粒(AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA),適合含稀有密碼子基因表達 四環(huán)素、卡那霉素
BL21 Origami B (DE3) 含二硫鍵蛋白表達 有助于含二硫鍵蛋白的活性蛋白質(zhì)形成 四環(huán)素、卡那霉素
Origami 2 (DE3)   trxB和gor基因上同時含有突變,利于含二硫鍵蛋白的折疊與氧化 四環(huán)素、鏈霉素、卡那霉素
BL21 trxB (DE3)   擁有硫氧還蛋白還原酶突變體,利于二硫鍵在細胞質(zhì)中形成,適合含二硫鍵蛋白的正確折疊和表達 卡那霉素
Rosetta-gami (DE3) pLysS 二硫鍵氧化,稀有密碼子表達 TrxB和Gor基因突變,利于含二硫鍵蛋白質(zhì)正確折疊,同時含有稀有密碼子tRNA 氯霉素、卡那霉素、鏈霉素、四環(huán)素
Rosetta-gami 2(DE3)   攜帶有TrxB和Gor基因突變,利于含二硫鍵蛋白質(zhì)正確折疊,同時含有稀有密碼子tRNA 四環(huán)素

胞內(nèi)表達與分泌表達:通常情況下,大腸桿菌表達重組異源蛋白質(zhì)采用胞內(nèi)形式表達,具有表達量高的優(yōu)勢,但是大腸桿菌高還原性及缺乏折疊伴侶分子的胞內(nèi)環(huán)境導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)在胞內(nèi)表達時易形成包涵體。此種情況下,還可以考慮分泌表達。
細菌培養(yǎng)條件優(yōu)化:大腸桿菌的培養(yǎng)環(huán)境也是影響外源蛋白質(zhì)可溶性表達的關(guān)鍵因素之一,這些因素包括溫度、pH、微量元素等。溫度對細菌生長和重組蛋白質(zhì)表達的影響是多方面的,包括細菌的生長速度、蛋白質(zhì)合成速度、重組蛋白質(zhì)折疊前體的聚集傾向程度、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和生物活性,以及重組蛋白質(zhì)的溶解度等。綜合效益來看,降低溫度往往更有利于重組蛋白質(zhì)的可溶性表達。因此從培養(yǎng)條件的角度,優(yōu)化培養(yǎng)溫度對提高蛋白質(zhì)比例影響最大。pH也是影響蛋白質(zhì)表達形成的因素之一,大腸桿菌生長的最適pH在6.5~7.5,與外源蛋白質(zhì)等電點相差越大,所表達的蛋白質(zhì)就更容易形成可溶性蛋白質(zhì)。因此需要根據(jù)菌體和目的蛋白的特點選擇合適的pH,并保持培養(yǎng)基中pH 相對穩(wěn)定。微量元素也能夠影響蛋白質(zhì)的表達形式。研究表明向培養(yǎng)基中加入微量元素(Zn2+、Mg2+等)可以提高目的蛋白的可溶性表達。這可能是因為異源蛋白質(zhì)二硫鍵的形成是一個酶依賴性反應(yīng)過程,向培養(yǎng)基中添加適量金屬離子,能夠在一定程度上提高部分酶的活性,進而促進重組蛋白質(zhì)折疊與穩(wěn)定性。
促溶標簽融合表達:促溶標簽融合表達在增加重組蛋白質(zhì)產(chǎn)率及提高可溶性表達比例等方面具有重要應(yīng)用意義。常用促溶標簽包括麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、小泛素樣修飾蛋白(SUMO)和硫氧還蛋白(Trx)等。
 重組蛋白質(zhì)表達常用融合標簽類型Commonly used solubility-enhancing tags

融合標簽 大小/aa 功能 特征
MBP (Maltose-binding protein) 396 防止聚集沉淀 極強促溶
NusA (N-utilization substance) 495 輔助折疊 促溶
Trx (Thioredoxin) 109 輔助二硫鍵氧化 改善胞內(nèi)還原性
SUMO (Small ubiquitin modifier) 100 促溶、輔助折疊 特異性蛋白酶識別(Ulp-1)
GST (Glutathione-S-transferase) 211 促溶表達 形成二聚體

分子伴侶共表達:通過分子伴侶協(xié)助重組蛋白質(zhì)折疊提升重組蛋白質(zhì)可溶性表達的方式主要為將分子伴侶基因協(xié)同插入在表達載體上,使其與目的基因共表達,應(yīng)用中常見的策略有單種分子伴侶過表達和多種伴侶系統(tǒng)協(xié)同過表達。
 大腸桿菌表達體系常用分子伴侶Commonly used chaperone family member in E. coli

分子伴侶家族 大腸桿菌體系
對應(yīng)家族
功能 應(yīng)用
HSP60 GroEL
GroES
高度協(xié)調(diào)和對稱變構(gòu)輔助蛋白質(zhì)折疊 GroEL
GroES
GroEL-GroES(ELS)
HSP70 DnaK
DnaJ/GrpE
減少錯誤折疊蛋白質(zhì)的聚集并促進蛋白質(zhì)水解;穩(wěn)定未折疊蛋白質(zhì) DnaK
DnaJ
DnaK-DnaJ
DnaK-DnaJ-GrpE(KJE)
HSP90 HptG 減少錯誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)的聚集 HptG
HSP100 ClpA
ClpB
拆分含有錯誤折疊蛋白質(zhì)的聚集體 ClpA
ClpB
sHSP IbpA
IbpB
保護熱變性蛋白質(zhì)不發(fā)生不可逆聚集;結(jié)合并穩(wěn)定變性蛋白質(zhì) IbpAB
Trigger factor Trigger factor 核糖體相關(guān)伴侶 TF

大腸桿菌N-糖基化修飾:重組異源蛋白質(zhì)在大腸桿菌中難以可溶性表達的主要因素之一在于缺乏翻譯后修飾功能,其中糖基化修飾對重組異源蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和溶解性具有極大影響。在一定程度上,缺乏糖基化修飾是影響真核蛋白在大腸桿菌中可溶性表達的最主要因素。

蛋白質(zhì)錯誤折疊或未折疊以及形成包涵體是大腸桿菌表達體系應(yīng)用的巨大阻礙。因此,探索可溶性表達策略對應(yīng)用大腸桿菌體系生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)意義重大。重組蛋白質(zhì)自身的氨基酸組成、親疏水性強弱、分子量大小、結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度、結(jié)構(gòu)折疊難易程度、二硫鍵形成與否、二硫鍵數(shù)量及重組蛋白質(zhì)的合成速度等均能影響重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌表達體系中的表達形式和可溶性表達比例。因此,在大腸桿菌表達體系中實現(xiàn)更多重組異源蛋白質(zhì)的可溶性與功能性表達仍然有諸多挑戰(zhàn),未來還將從以下幾個方面持續(xù)改進:其一,不斷完善重組異源蛋白質(zhì)在胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)折疊輔助體系,包括分子伴侶、融合伴侶等的設(shè)計與開發(fā);其二,進一步優(yōu)化提高在原核宿主系統(tǒng)中的二硫鍵氧化與正確形成能力;其三,持續(xù)改善大腸桿菌表達體系的糖基化能力和形式,包括糖基化效率和糖基化糖型優(yōu)化等。


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